自由基与临床疾病

自由基作为一类化学实体在20世纪初就已被人们所认识,生物体系中的自由基的存在,在20世纪50年代才得以确认。随着分析方法特别是近代生物物理检测技术的发展,许多生命现象的自由基机制逐渐被揭示,目前已形成了自由基医学和自由基生物学等新兴学科。自由基理论已渗入到临床诸多学科,为疾病的病因,发病机制提供了新的理论依据,为许多疾病的诊断与防治开辟了新的途径与前景。本章将介绍自由基的基本概念,生化基础以及与临床疾病的关系。作为医学检验专业的教材,本章还将介绍自由基的检测方法及其方法学评价。

自由基的危害.jpg

第一节 自由基的生化基础

一、自由基的概念与种类

自由基(free radical)是指能独立存在,含有未成对电子的原子,原子团、分子或离子。如含有不成对电子的氧则称为氧自由基(oxygen free radical,OFR), 占机体内自由基的95%以上。一般在自由基前面或后面(也可在右上角)用一个圆点"·"表示未成对电子。自由基的不成对电子具有配对趋向,夺取或失去一个电子构成配对电子。因此自由基十分活泼,极易与周围分子发生反应,它存在的时间极短,其半寿期以毫秒或毫微秒计。

自由基在生物体内普遍存在,按其化学结构自由基可为分为三种类型:①半醌类自由基,如黄素类半醌自由基;②氧中心自由基,简称氧自由基,包括超氧阴离子自由基(O2 )、羟自由基(·OH)、烷氧自由基(RO·)、烷过氧自由基(ROO·)、氢过氧自由基(HOO·)。近年来研究较多的活性氮自由基(NO和NO2-)也可算作氧自由基。③其他碳、氮、硫中心自由基。上述氧自由基及其衍生物H2O2、脂质过氧化物(LOOH)及单线态氧(1O2,singlet oxygen)等统称为活性氧(reactive oxygen species, ROS),它是指氧的某些产物和一些反应的含氧产物,它的特点是含有氧,化学性质较氧活泼。ROS对生物机体可产生一系列的有害作用,其毒害作用称为氧的毒性。种种有害后果与许多疾病的发生密切相关,因此生物体内ROS的生成与清除的平衡对生命过程的正常进行具有重要作用。

一氧化氮(nitric oxide, NO)是20世纪80年代发现的一种自由基,它是体内重要的信使分子和效应分子,是当代医学研究的热点和前沿之一。NO的化学性质活泼,可迅速与O2、O2 、铁、铜、镁等反应,其中与O2 反应可生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-),后者是一强氧化剂。在生物体内,与NO有关的自由基和化合物有数十种,NO及其相关产物相互反应,在机体内生成一系列具有重要生物功用的自由基和硝基化合物,即所谓的生物活性氮。

NO在生物体内主要是由NO合酶(NO synthase, NOS)催化合成与释放的,即NOS催化L-精氨酸和O2为底物生成NO和L-瓜氨酸。根据NO的表达与调节,NOS分成两大型:一是组成型NOS(constitutive NOS, cNOS),其活性依赖于Ca2+和钙调蛋白,可间歇性不断表达,根据存在部位,又分为神经元型和内皮细胞型。二是诱导型NOS(inducible NOS,iNOS), 其活性不依赖于Ca2+和钙调蛋白, 但受细胞因子和特殊的信号分子刺激和诱导,在生理条件下不表达,细胞受刺激时才高表达。主要存在于巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等。

NO可作为信号分子在体内起重要生理作用。它可作用其靶受体---可溶性的鸟苷酸环化酶,激活该酶使GTP环化为cGMP,后者再刺激cGMP依赖的蛋白激酶,调节磷酸二酯酶和离子通道,发挥一系列生物效应:松弛平滑肌、舒张血管,抑制平滑肌细胞增殖,抑制血小板粘附和聚集,保护细胞、增加神经递质释放。NO还可介导炎症时巨噬细胞和中性粒细胞杀灭微生物的作用。
除此之外,NO还可作为细胞毒分子,参与多种疾病的病理过程。

二、自由基的产生

人体内自由基的来源有外源性和内源性两种。

(一)外源性自由基

1.电离辐射及大气污染 如γ和X射线、紫外照射可使人体内产生·OH;汽车排出的碳化氢,空气烟雾中的氟利昂等经太阳紫外线照射及光分解产生多种碳的自由基及卤原子;大气中的臭氧也可能转变成过氧化物自由基。香烟燃烧的烟气可产生大量的自由基。 

2.药物 解热镇痛药、抗结核药、硝基化合物药物、含醌式结构的抗癌药(如博莱霉素)、类固醇激素等进入体内可产生O2 、·OH及H2O2等。

3.其他 如环境污染的镉、水银、铅等重金属离子及杀虫剂的毒性与自由基相关;茶叶和植物油在空气中放置过久,自由基含量增加。

(二)内源性自由基

细胞内线粒体、内质网、细胞核、过氧化物酶体、质膜及胞液等都可产生自由基。其中有些是酶促反应,有些是非酶促反应。

1.O2 的产生 通过线粒体中的辅酶Q·半醌、内质网膜上细胞色素P450和血红蛋白、肌红蛋白、肾上腺素等自氧化作用均可产生O2 。

SQ·+O2 ────→ Q + O2
胞液中的黄嘌呤氧化酶与醛氧化酶、线粒体中的黄素蛋白酶、内质网中的NADPH-细胞色素P450还原酶和质膜上的NADPH氧化酶等酶促氧化过程中均可产生O2 。
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤+2O2+H2O ───────→尿酸+2O2 +2H+

2.·OH的产生 机体内中的·OH的生成主要是通过Fenton反应由O2直接衍生形成,该反应是先由歧化反应(既可自发歧化,也可酶促歧化)催化O2生成H2O2,后者再与O2在过渡金属离子存在下转变为毒性更强的·OH,这是体内·OH的主要来源。

O2 + O2 + 2H+ ────────→H2O2+O2 (歧化反应)
过渡金属离子
O2 +H2O2 ────────→O2+·OH+OH-(Fenton反应)
歧化反应是指反应中的某种底物既能作为还原剂供应电子,又可作为氧化剂接受电子。上述反应中的O2 就承担这种角色,故属于歧化反应。
过氧化物酶体中多种需氧脱氢酶催化生成的H2O2,如不迅速被分解,在Fe2+的催化下也可生成·OH。
H2O2+Fe2++H+ ──→·OH+H2O+Fe3+

3.吞噬细胞中活性氧的产生 粒细胞、单核细胞、巨噬细胞在吞噬细菌或炎症刺激物的刺激时,由NADPH氧化酶介导生成的O2 ,经歧化反应生成H2O2。后者除可生成·OH外,在Cl-存在时,经髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的作用,生成活性很强的次氯酸(HOCl)和1O2,1O2是一个强的亲电子性的氧化剂。

MPO
H2O2+Cl- ───────→ H2O+OCl-
MPO
OCl-+H2O2 ──────→ H2O+1O2+Cl-

4.脂质过氧化作用 机体通过酶促反应和非酶促反应产生的活性氧,能攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)引发一种自由基链式反应,链式地产生脂质过氧化物(又称脂氢过氧化物),这种作用就称为脂质过氧化作用(lipid peroxidation)。即在光或某种射线或自由基的作用下,可使PUFA脂质分子(用LH表示)脱去1个氢原子形成脂质自由基(L·),此脂质自由基与氧反应形成脂质过氧自由基(LOO·),后者再进攻其他脂质分子,夺取其氢原子,再生成新的自由基和LOOH,此反应可反复进行,从而导致PUFA分子的不断消耗和LOOH的大量产生。在过氧化条件下,它们是不稳定的,能分解成一系列复杂产物,包括小分子的醛、酮、醇、醚、羧酸、烷烃和烯烃产物以及氧自由基。通常以小分子降解产物的数量表示脂质过氧化的程度。

三、自由基的清除机制

机体内的自由基在不断地产生,同时也不断地被清除。体内存在着抗氧化酶及小分子抗氧化剂两类对自由基的清除系统,以保护机体免遭损害。从而保证在正常生理情况下,各种自由基的浓度维持在一个有利无害的、生理性低水平。

(一)抗氧化酶类

1.超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) SOD的作用催化歧化反应以清除O2 。
SOD
2O2 + 2H+ ──────→H2O2+O2
SOD是金属酶,包括三种同工酶,在真核细胞胞液中,以Cu2+-Zn2+为辅基,称为CuZn-SOD;在原核细胞及真核细胞的线粒体中以Mn2+为辅基,称为Mn-SOD;在原核细胞还有以Fe3+为辅基的Fe-SOD。

2.过氧化氢酶(catalase, CAT) CAT可清除O2的歧化产物H2O2,而后者往往是·OH的前体。
CAT
2H2O2────→H2O+O2

3.硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium dependent glutathione peroxidase, SeGSHPx) 它可清除LOOH或H2O2,从而抑制自由基的生成反应。
SeGSHPx
LOOH(H2O2)+2GSH ──────→ LOH(H2O)+H2O+GSSG
还有一种新的硒酶,称磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PHGSHPx),它能清除生物膜上的磷脂氢过氧化物,防止生物膜的脂质过氧化。PHGSHPx是单体酶,而SeGSHPx是由4个同一亚基构成的寡聚酶。

4.谷胱甘肽硫转移酶(GST) GST是属不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶,它只清除LOOH,而不能清除H2O2。
GST
LOOH+2GST ──→ LOH+H2O+GSSG

5.与抗氧化作用相关的其他酶 如醛酮还原酶,它可催化脂肪醛和脂肪醛-谷胱甘肽加成物的还原,以清除脂质过氧化作用的毒性产物。

(二)抗氧化剂

1.脂溶性抗氧化剂 

(1)维生素E:存在于生物膜、脂肪细胞脂滴和血浆脂蛋白内。它能清除O2、·OH、LOO·及1O2,从而防止自由基引发的脂质过氧化。

(2)β-胡萝卜素:可清除1O2、LOO·、O2 、及·OH,防止脂质过氧化。

(3)辅酶Q:既参与自由基的生成也具有抗氧化作用,还原型辅酶Q(CoQH2)较氧化型的抗氧化作用强。其抗氧化机制目前尚未阐明。

(4)固醇类激素:雌激素具有抗氧化活性,可能与其结构中的酚基相关。但大剂量使用可生成O2,诱导肿瘤发生,故应慎用。皮质激素能防止内毒素脂多糖激活中性粒细胞膜上的NADPH氧化酶,避免由此产生O2,以减轻脂质过氧化。

2.水溶性小分子抗氧化剂 

(1)维生素C(又称抗坏血酸):能直接与·OH、O2 和1O2作用,是机体重要的活性氧清除剂,在防止生物膜免受自由基攻击方面具有重要作用。此外,维生素C还可与维生素E自由基(VE·)反应,使其恢复为还原型维生素E,而本身变成维生素C自由基(VC·),后者可由依赖于NADH的氧化还原酶系统还原成维生素C。因此维生素C与维生素E两者有协同作用。

值得注意的是,维生素C并不都是起好作用,它可将Fe3+还原成Fe2+,当有H2O2存在时,可通过Fenton反应形成·OH;但它又可清除·OH。因此维生素C的总效果与它的浓度有关。

(2)谷胱甘肽(GSH):它是体内含量最高的非蛋白质巯基化合物,为H2O2、LOOH、·OH和1O2重要清除剂。

H2O2+2GSH ──→ GSSG+2H2O
LOOH+GSH ──→ GSSG+LOH+H2O
·OH+GSH ──→ H2O+GS·
2GS· ──→ GSSG

(3)尿酸:是人体嘌呤代谢的终产物,通常被认为是废物,没有生物学功能。但目前认为它是一种很好的抗氧化剂,可有效地清除1O2和·OH,抑制脂质过氧化。

(4)色氨酸代谢产物:3-羟犬尿酸,黄尿酸和3-羟邻氨基苯甲酸均是色氨酸的代谢产物,它们均含有酚羟基,可抑制脂质过氧化作用。 

3.蛋白性抗氧化剂

(1)铜蓝蛋白:是人血浆的含铜蛋白,是细胞外液重要的抗氧化剂之一。它具有亚铁氧化酶活性,能催化Fe2+氧化成Fe3+,抑制由Fe2+催化H2O2生成·OH的反应,从而防止·OH引发的脂质过氧化作用。此外铜蓝蛋白还是吞噬细胞呼吸爆炸生成的氧代谢产物O2和OCl-的主要清除剂。

(2)清蛋白结合的胆红素:一般认为胆红素是脂溶性毒性产物,需要被排出。但目前认为它是机体抗防御系统中的一员,它能有效地清除1O2、O2 和LOO·。清蛋白结合的胆红素能保护与清蛋白结合的不饱和脂肪酸和清蛋白本身免受活性氧损伤。胆红素由肠道排泄,作为肠道的抗氧化剂保护维生素A和不饱和脂肪酸免受氧化破坏。此外,近年来的研究还表明,胆红素在μmol/L浓度时即能保护血浆蛋白免受过氧亚硝酸致的氧化修饰,以及通过修复蛋白自由基或通过清除自由基减轻血浆蛋白损伤。

(3)其他血浆蛋白:如清蛋白可结合铜离子抑制·OH形成和有效清除OCl-。结合珠蛋白和血液结合素(hemopexin)能与血红蛋白(Hb)结合,促使Hb由受损组织和炎症局部排出,以减轻Hb对组织的损伤作用。转铁蛋白和乳铁蛋白,对铁催化的脂质过氧化作用是强氧化剂。此外转铁蛋白还能清除OCl-。

上述抗氧化酶与抗氧化剂均属于机体的抗氧化防御系统。

4.近年来发现的抗氧化剂

(1)别嘌呤醇:是黄嘌呤氧化酶的抑制剂,能降低O2 的生成,是心肌缺血再灌注氧自由基抑制剂,但只有在灌注前用药,才能收到明显效果。

(2)二甲亚砜及甘露醇:两者均具有清除·OH的作用。二甲亚砜近年来已用于抗脑水肿。

(3)钙拮抗剂:尼可地平、硝苯啶、维拉帕米和硫氮卓铜等有保护细胞和升高GSH的作用。

(4)白细胞功能抑制剂:前列环素(PGI2)是血管内皮细胞产生的花生四烯酸主要代谢物,能抑制血小板聚集,保护冠状动脉。它还能阻止中性粒细胞激活,减少自由基生成。

(5)N-乙酰半胱氨酸:是小分子氨基酸衍生物,除了它本身是抗氧化剂外,它还是细胞内合成GSH的原料。近年发现它还具有抗病毒和调节免疫功能的作用。

(6)普罗布可(Probucol):是一种很强的脂溶性抗氧化剂或自由基清除剂, 该药有延缓泡沫细胞发生的能力,可用于动脉粥样硬化的辅助治疗。

5.中草药抗氧化剂 

我国学者应用近代生物医学理论与技术从多层次、多学科研究中医中药基本理论和治剂实质,取得了许多有应用价值的结果。中药抗氧化机制包括清除氧自由基和羟自由基,抑制脂质过氧化反应,抑制生物膜不饱和脂肪酸过氧化反应,缓解氨基多糖的解聚作用等。这些中草药抗氧化剂的有效成分有黄酮类、皂甙类、生物碱类、鞣质类、多糖类、苯酚类等。具有抗氧化作用的单味药有很多,如人参、西洋参、党参、太子参、黄芪、枸杞子、灵芝、丹参、三七、当归、生脉散、五味子、何首乌、甘草、女贞子、附子等等。当然单一的中药抗氧化剂是远远不够的,应进行中西药联合应用。

6. 美目蓝莓愫片

第三代复合型专业抗氧化剂 国家药监局批准的第一个专业抗氧化剂产品。它可以使体内的内源性抗氧化物质(谷胱甘肽抗氧化酶GSH、超氧化歧化酶SOD、硫辛酸LiPoic Acid、辅酶Q10)大幅提升,促进外源性和内源性抗氧化物质共同作用,形成抗氧化共生环,它的抗氧化能力是普通抗氧化剂的10倍以上,抗氧化容量高达12183 单位ORAC。是目前国际上最新流行的第三代复合型专业抗氧化剂。


第二节 生物体内自由基的作用

在正常情况下,人体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡之中。在生理状态下,自由基的浓度很低,不仅不会损伤机体,而且还显示出独特的生理作用。但是自由基产生过多或清除过慢,它会对生物体产生一系列损害,加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。

一、自由基对细胞的损害作用

自由基非常活泼,化学反应性极强,参与一系列的连锁反应,能引起细胞生物膜上的脂质过氧化,引起细胞损伤。其机制比较复杂,主要有三方面:膜脂改变导致膜功能的障碍和膜酶的损伤;脂质过氧化过程中生成的活性氧对酶和其他成分的损伤;LOOH的分解产物特别是醛类产物对细胞及其成分的毒性作用。

(一)自由基对脂类和细胞膜的破坏

细胞膜和亚细胞器膜都是以双分子层的PUFA为骨架的,最易受到自由基的攻击发生脂质过氧化反应,导致膜内不饱和脂肪酸减少,膜结构遭到破坏,使其流动性、通透性、离子转运及屏障功能受损,脂质过氧化还可引起溶酶体酶的释放,线粒体膨胀、酶的失活等损伤。红细胞膜发生脂质过氧化则可导致溶血。微粒体脂质过氧化作用后有多聚核糖体的解聚和蛋白质合成的抑制。LOOH进一步分解产生醛类,尤其是丙二醛(MDA)可作为交联剂与一些蛋白质、核酸、脑磷脂等反应,导致分子间的交联聚合。细胞膜的损害则会导致细胞代谢、功能和结构的改变,后者是许多疾病的病理基础,从而可引起许多病变。

(二)自由基对蛋白质和酶的损害

自由基既可直接作用于蛋白质,与最邻近的氨基酸反应发生蛋白质过氧化;也可通过LOOH间接作用于蛋白质,使蛋白质的多肽链断裂或与个别氨基酸发生氧化反应或使蛋白质交联而发生聚合作用,从而使蛋白质的结构发生变化,导致细胞功能紊乱。如老年人皮肤起皱、骨骼变脆等都与胶原蛋白破坏和功能改变有关。

酶的化学本质绝大多数是蛋白质,因此许多自由基和自由基反应的产物往往也可影响酶的活性。脂质过氧化、电离辐射、其他产生的自由基的反应可以通过多种途径影响酶的活性。如通过自由基链反应,使酶分子发生聚合;通过LOOH中的MDA使酶分子发生交联;通过破坏酶分子中氨基酸以及与酶分子中的金属离子反应,影响酶活性。

(三)自由基对核酸和染色体的损害

自由基可与碱基或五碳糖发生反应,生成碱基自由基或在DNA的脱氧核糖部分形成自由基,最终使DNA链断裂或碱基破坏、缺失,使核酸分子的完整性和构型受到破坏,造成遗传信息改变,使生物体发生突变或产生病变;严重损伤的DNA无法修复,以致造成细胞死亡。辐射作用于核酸环境中的水分子,使其电解产生·OH和O2,辐射可使DNA主链断裂、碱基降解和氢键破坏。

自由基对DNA的破坏可导致染色体变异,电离辐射和化学物质也可使受损细胞的染色体断裂,此作用与O2 和·OH有关。

(四) 自由基对糖分子的损害

自由基可使组成核酸的核糖、脱氧核糖形成脱氢自由基,从而造成DNA主链断裂或碱基破坏;自由基可使细胞膜中的糖分子羟基化,破坏细胞膜上的多糖结构,影响细胞功能的发挥;自由基还可通过氧化降解使多糖破坏,影响组织功能,如脑组织中的多糖遭到破坏就会影响大脑的正常功能。

脂类、蛋白质、核酸、糖类是组成生物体的基本而重要的化合物,这些物质一旦受损,生命活动将受到威胁,自由基对生物体的危害就在于能破坏这些生物大分子,使细胞受损,机体患病,如动脉粥样硬化,糖尿病,肿瘤,胃肠道功能失调,感染,免疫失调等。


第三节 自由基与临床疾病的关系

大量资料已经证明,炎症、肿瘤、衰老、血液病、糖尿病以及心、肝、肺、肾、脑、皮肤等100多种疾病的发生机理与体内自由基产生过多或清除自由基能力下降有密切关系。自由基是疾病和衰老的元凶。本节将介绍与自由基相关的一些常见疾病。

一、自由基与心血管疾病

(一)自由基与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一组称为使动脉硬化的血管病中常见而最重要的一种。AS的发病机制尚未明了,脂肪浸润、血小板聚集、血栓形成和克隆等多种学说从不同角度阐明了其发病机制。

近年来自由基与LOOH在AS发病机制中的作用受到普遍关注。高血压、高血脂、糖尿病、吸烟等易患因素均可增加细胞的脂质过氧化损伤,促进AS形成。

一方面,自由基和LOOH可引起血管内皮细胞(EC)肿胀和破损,导致动脉硬化发生。另一方面,低密度脂蛋白(LDL)受到自由基作用,形成过氧化低密度脂蛋白,大量沉积于EC,最终形成AS。此外,过氧化低密度脂蛋白可以导致血小板聚集,促使自由基大量产生,从而加速AS发展。

有研究表明,高血脂时体内自由基产生和清除平衡破坏,许多自由基清除剂(如SOD、CAT)活性降低,会产生大量的LOOH。后者可改变EC的结构与功能,损伤EC生物膜系统,使其通透性增加,使巨噬细胞粘附,炎性细胞浸润并释放各种生长因子,刺激血管中膜平滑肌细胞(SMC)移行于内膜增生,吞噬及分泌大量间质成分,动脉内膜局灶增厚并形成纤维斑块。此外LOOH的产物MDA极易修饰LDL为MDA-LDL,后者能被巨噬细胞受体所辨认、内吞,形成泡沫细胞。

氧自由基和细胞膜中的PUFA反应生成L·或LOOH,后者可以邻近的PUFA发生链式反应,改变细胞膜PUFA与磷脂的比例,降低膜的流动性;通过LOOH产生的醛类引起膜蛋白与磷脂之间的交联,破坏膜蛋白功能。此外,氧自由基还可通过LDL和高密度脂蛋白(HDL)的氧化修饰途径来影响EC的形态与功能,导致AS形成和发展。

氧自由基介导的脂质过氧化反应损伤EC后,其合成、分泌PGI2、内皮源性舒张因子(EDRF)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的能力下降,调节血管舒缩与抗血栓形成等功能受损,从而促进AS形成。其机制是:首先,PGI2合成酶受到抑制,前列腺素转化成TXA2,引起PGI2/TXA2失调导致血小板聚集并释放5-羟色胺等活性因子,加重受损部位的病理变化;其次,EDRF分泌减少,促进EC和SMC由收缩表型向合成表型转变,最终导致内膜增生和AS形成。

近年还发现:AS的发生与·OH和次氯酸致的蛋白氧化修饰也存在相关性,分子生物学研究发现,AS病灶中EC、SMC及单核细胞的SiS基因表达明显增强。自由基刺激血管SMC的增殖,参与了原癌基因的激活及异常表达,从基因水平揭示了氧自由基与AS之间的密切关系。

(二)自由基与心肌缺血再灌注损伤

在缺血的基础上恢复血流后,组织器官的损伤反而加重的现象称为缺血再灌注损伤。组织缺血再灌注损伤与一些疾病的发生发展密切相关。心肌梗塞和脑梗塞的治疗,体外循环和心胸外科手术,器官移植以及各种原因所致的休克、急性肾功能不全等,都必然经历一个缺血再灌注过程。近年来活性氧在缺血再灌注损伤中的作用已受到人们的关注并进行了大量的研究,这里仅介绍心肌缺血再灌注损伤。目前心肌缺血再灌注损伤的确切机制仍不明了,与自由基作用有关的机制有:

(1) 缺血再灌注时自由基引发的脂质过氧化增强,组织及血浆中LOOH显著增高,超微结构严重受损。给予抗氧化剂如维生素E、SOD及硒能显著减轻缺血/再灌注损伤。

(2) 细胞膜脂质过氧化改变膜酶、离子通道的脂质微环境,从而使膜通透性增高,细胞外钙离子内流。膜上Na+-K+-ATP酶失活,可使细胞内Na+升高,Na+-Ca2+交换增强,造成细胞内钙超载。

(3) 线粒体膜富有磷脂,缺血再灌注时自由基引发的线粒体膜脂质过氧化或细胞内形成LOOH作用于线粒体膜,使膜的液态及流动性改变,从而导致线粒体功能障碍,高能磷酸化合物产生减少,自由基产生增多,细胞丧失能量贮备。依靠能量的质膜及肌浆网膜钙泵,由于能量不足不能将肌浆中过多的Ca2+泵出或吸收入肌浆网,致使心肌细胞内Ca2+浓度增加,加上由细胞外来的Ca2+终于造成细胞内Ca2+超载,成为细胞致死原因。

(4) 自由基引发的脂质过氧化造成细胞成分间的交联(脂质-脂质交联、蛋白-蛋白交联、脂质-蛋白交联、蛋白-胶原交联),使整个细胞丧失功能。

(5) 缺血再灌注时,微粒体及质膜上的脂加氧酶及环加氧酶被激活,催化花生四烯酸代谢,在加强自由基产生及脂质过氧化的同时形成具有高生物活性的物质,如前列腺素、TXA2等。缺血再灌注时血栓素形成增加,PGI2形成减少,因而造成微循环障碍。

总之,自由基即使不是缺血再灌注损伤的唯一发病因素,至少也是甚为重要的环节。

二、自由基与肿瘤

半个世纪以来,人们对自由基在肿瘤发生发展中的作用及其作用机制研究,在肿瘤发展过程中的变化规律作为临床早期诊断指标;在抗癌药的自由基代谢及药理意义和自由基清除剂及抗氧化剂在肿瘤防治中的作用及意义等方面进行了大量的研究,并经历了几次曲折起伏过程。目前自由基与肿瘤发生发展关系的研究,已成为国际上肿瘤基础理论研究的重大课题。

(一) 自由基与化学致癌

早在上世纪70年代Miller就提出著名的致癌物亲电子理论。细胞内存在许多使外来化合物代谢为自由基和生成活性氧的酶,外来化合物的增加和酶活性升高必然会造成细胞内氧自由基和活性氧的堆积,从而引起生物大分子损伤,在致癌与促癌过程中起一定作用。在体内化学致癌物代谢过程中,虽然不能认为自由基一定是活性的最终致癌代谢产物,但它确实在某些化学致癌活化代谢过程中起重要作用。活性氧可在诸多化学致癌物代谢过程中产生,并可能与其协同发挥致癌作用。活性氧或自由基的存在也促进某些致癌物的活化代谢。

(二) 自由基与促癌作用

肿瘤的发生是一个复杂的多阶段过程,目前认为可分为启动、促癌与进展阶段。自由基特别是活性氧在促癌过程中起重要作用,许多促癌剂都能通过直接或间接方式产生活性氧,通过对生物大分子的作用起促癌效应。目前认为自由基与促癌作用密切相关的证据有:①产生自由基的一些物理、化学因素有促癌作用;②某些促癌剂可刺激细胞内源性产生一系列活性氧产物;③活性氧生成系统可模拟促癌物的某些生物学反应;④促癌剂可影响某些细胞的抗氧化防御系统;⑤自由基清除剂和抗氧化剂可以抑制促癌作用,且目前已应用于临床预防某些肿瘤发生的实践中。

(三) 自由基致、促癌机制

许多因素均可导致细胞内自由基和活性氧的增加,过多的自由基、活性氧可与细胞内许多重要的生物分子作用,如核酸、蛋白质、脂和多糖等,造成细胞结构和功能的改变,由此引起和促进肿瘤的发生和发展。

1.自由基对DNA的作用 其分子机制是电离辐射可直接作用于DNA,产生自由基,也可间接产生羟基DNA自由基,在有氧条件下DNA自由基与氧作用成为过氧自由基,这些自由基是造成DNA链断裂的原因。

2.自由基对蛋白质的作用 主要是修饰氨基酸残基,引起结构和构象的改变,造成肽键断裂,聚合和交联,造成细胞选择性生长和改变基因表达。

3.自由基对脂质的作用 自由基能攻击生物膜磷脂中的PUFA,引发脂质过氧化作用,该作用不仅可以使活性氧转化成活性化学剂,即非自由基性的脂类分解产物,而且可通过链式反应放大活性氧的作用。因此自由基不但可通过生物膜中的PUFA的过氧化引起细胞损伤,而且还可通过LOOH的分解产物引起细胞的损伤。 

4.基因损伤与致、促癌的关系 致、促癌物可造成基因损伤,基因损伤主要为DNA单链或双链的断裂,重排或碱基修饰。化学致癌物的最终致癌形成包括某些自由基可选择性作用于DNA的核苷酸而激活原癌基因造成原癌基因突变。癌基因发生的DNA重排,包括易位、缺失、插入和扩增都可能造成细胞的恶性转化,成为被启动的细胞。致癌物的作用是修饰基因造成永久性的不可逆损伤,而促癌剂可能类似一些激素,能短暂地增加某些特殊DNA的转录过程,产生的·OH可造成断裂,但没有特定的部位,即没有选择性,且可迅速被修复。

总之,自由基和活性氧的致、促癌作用是一个多环节的复杂过程,在启动阶段,自由基参与致癌物作用于DNA,造成染色体损伤和基因突变。在促癌过程中自由基,特别是活性氧,除损伤及作用DNA促进突变的基因表达外,还损伤其他生物分子如蛋白质、脂质及细胞内其他与生长、增殖、调控有关的信息转导系统的许多因子,从而促进表型表达和导致肿瘤的发生与发展。

二、自由基与衰老

人的生命周期中有一个随时间进展而表现出不断恶化,直到死亡的过程,老年医学将该过程称为衰老(aging或senscence)。它是生物体随着增龄而发生的退行性变化的总和,表现为机体功能活动的进行性下降,机体维持内环境恒定和对环境的适应能力逐渐降低。

衰老是机体的一个正常而又复杂的生物学现象,涉及面很广,从不同侧面研究生命衰老过程,形成了种种学说,如衰老的有害物质累积学说,内分泌功能减低学说,器官功能减退学说,衰老的免疫学说,大分子交联学说与衰老的基因学说,微量元素学说以及衰老的自由基学说与衰老线粒体学说。自由基学说是现代抗衰老学说中的较受重视的一种。
Harman在1956年就提出了衰老的自由基学说,认为体内过量的自由基及其所诱导的氧化反应长期使细胞受到损害,导致人体衰老和死亡。我国关于衰老理论,特别是氧化剂的研究直接或间接地丰富和发展了衰老的自由基学说。

目前认为自由基引起衰老的机制有:随着年龄的增长,人体就不能维持自由基产生和清除之间的动态平衡,使得人体内有大量过剩的自由基积累。过多的自由基可引发细胞膜脂质氧化,脂质过氧化的产物MDA,也造成细胞内核酸变性及功能障碍,当这些损害物积累时机体就向老化发展。褐脂素在人的手、脸部皮肤上沉积,形成"老年斑",是衰老的基本特征,脂褐素的形成涉及脂质过氧化,并与生成的脂质过氧化物-蛋白质共聚物以及MDA促进蛋白质等生物大分子交联有关。

与衰老自由基学说有关的还有1978年Zs-Nagy提出的衰老膜学说(the membrane hypothesis of aging, MHA),即由于自由基诱导脂质和蛋白质交联以及质膜上所产生的残热可引起细胞膜物理-化学特性的改变,且这种改变是通过随着年龄的增长而变化,从而使整个细胞产生退行性变化。

1972年Harman又提出线粒体衰老概念。20世纪80年代Miquel和Fleming提出细胞分化导致线粒体自由基增加是衰老的最初事件,衰老是细胞分化的代价,线粒体受到活性氧和自由基的攻击性氧化损伤,导致衰老的出现,因此提出了"衰老的氧自由基-线粒体损伤"的二阶段学说。1990年Bandy等阐明线粒体DNA突变可增加线粒体内氧应激水平由此引发衰老的出现。1992年Wallace等提出氧化磷酸水平下降与衰老和退行性病变,如阿尔茨海默氏病(AD, 亦称早老性痴呆)与帕金森病等有关。

不管是衰老的线粒体学说,还是衰老的自由基学说都可归结为:和自由基有关的线粒体DNA损伤和缺失以及线粒体内能量消耗的不断累积,又引起线粒体自由基的积累增加,导致线粒体功能的缺失,由此导致机体的不断衰老过程。

此外,胶原蛋白的交联度增加也与衰老有关,胶原蛋白的溶解度随年龄的增加而降低,造成交联度增加,胶原蛋白积聚变性引起器官功能的衰退并进而引起整体功能衰退,表现皮肤起皱、硬化和粗糙、脂溶性角化、骨骼变脆、眼晶状体的物理性状改变等。

三、自由基与其他常见疾病

自由基除了与上述几种疾病以外,还与其他系统的疾病有密切关系。如消化系统疾病中的胃炎、消化性溃疡、胃癌、原发性肝癌等;呼吸系统疾病中的上呼吸道感染、支气管哮喘、呼吸衰竭、成人窘迫综合征、阻塞性肺气肿、慢性肺源性心脏病、肺水肿等;泌尿系统疾病中的肾小球肾炎、肾中毒性病变、急性肾功能衰竭,慢性肾功能衰竭和肾移植后排异反应等;血液系统疾病中的巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血、急性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等;神经系统疾病中的脑水肿、颅脑损伤、高血压脑出血、脑梗塞等;代谢内分泌疾病中的糖尿病、肝豆状核变性、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。此外与自由基相关的新生儿疾病有新生儿窒息、新生儿缺血缺氧性脑病、新生儿肺炎、支气管肺发育不良等;妇产科疾病有流产、胎膜早破、子宫内膜异位症、妊娠高血压综合征、子宫颈癌、子宫内膜癌等。